酵母双杂交文库构建技术之SMART技术

酵母双杂交技术是研究蛋白功能的重要手段，酵母双杂交文库构建是寻找与已知蛋白相互作用的特异蛋白的前提，目前多种组织的cDNA文库已经被相继建立。SMART技术是酵母双杂交文库构建技术之一，应用较为广泛。

90年代兴起的一种研究蛋白质与蛋白质间相互作用的高新分析生物学技术——酵母双杂交技术，被广泛应用于信号转导、蛋白功能研究、癌基因研究、细胞凋亡等研究领域，不仅可以验证已知蛋白之间的相互作用，也可以从酵母双杂交文库中寻找与诱饵蛋白相结合的新的蛋白质，发现新基因，目前酵母双杂交实验服务已经成为了生物公司的一项常规服务。作为酵母双杂交研究的cDNA文库属于质粒文库，cDNA 便于克隆和大量表达，cDNA文库的构建和筛选是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。SMART技术常用来构建细胞酵母双杂交cDNA文库。

SMART技术的基本原理为：将线性质粒pGADT7-Rec和含有质粒两端相同序列的cDNA一起共转化酵母细胞，两者在酵母细胞中发生同源重组，形成完整的环状文库质粒，然后在相应的营养缺陷培养基中筛选，从而获得文库质粒。美迪西生物医药提供酵母双杂交实验服务，它拥有独立优质实验室和专业实验人员，可以出具权威检测数据报告，提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析。

为构建高质量的丹参c DNA文库以及通过酵母双杂交获得丹参Sm JAZ8互作蛋白基因，有研究者以丹参的根、茎、叶、花、毛状根为材料，利用SMART方式合成全长c DNA，并结合基于双链的特异性核酸酶(DSN)均一化技术，构建丹参的均一化全长c DNA文库[1]。通过文库鉴定，检测到c DNA文库库容为1.45×106，重组率为100%，插入片段平均大小为500~2 000 bp。构建p DEST-p GADT7-Sm JAZ8重组载体，将该载体转化Y2HGold菌种，通过酵母双杂交进行互作蛋白的筛选，最终筛选到了丹参Dna J蛋白和UBQ蛋白。该研究既成功构建了丹参均一化全长c DNA文库，又为后续丹参功能基因筛选和基因功能的研究奠定了基础。

还有研究者以酵母穿梭表达质粒pGADT7-Rec为载体，采用CLONTECH SMART技术，在酵母细胞中构建HL-60细胞的酵母双杂交cDNA文库[2]。方法是从体外培养的HL-60细胞中提取总RNA，利用经修饰的CDS引物合成cDNA第一链，在链的末端可自动延伸CCC，在反应体系中加入SMART^TM Oligo作为cDNA第二链合成的引物，进行长距离(LD)-PCR合成双链cDNA，后者经CLONTECH CHROMA SPIN+TE-4000柱纯化后，与线性质粒pGADT7-Rec共转化感受态酵母菌AH109，二者在酵母细胞中利用酵母细胞内具有较高的同源重组酶活性。

总之SMART技术在生物研究领域应用较为广泛，其在进行酵母双杂交文库构建时有众多优点：首先，SMART方法省去了诸多繁杂的实验步骤，节省了时间，简化了建库过程。其次，以微量的总RNA作为模板，不需要先进行mRNA的分离纯化，从而减少mRNA在分离纯化时的所导致的mＲＮＡ的降解。